Project Description

Presentación

La Plataforma de Proteómica del Instituto de Investigación Biomédica (INIBIC) es un laboratorio que ofrece servicios de Proteómica para el INIBIC, la Universidade da Coruña (UdC) y otras instituciones tanto públicas como privadas.
La Plataforma de Proteómica del INIBIC está asociada al Instituto Nacional de Proteómica (ProteoRed) desde 2006.

Proteómica: objetivos y aplicaciones

La proteómica es la ciencia que estudia los proteomas, que son conjuntos de proteínas que expresados a partir de un genoma. Los estudios genómicos han producido una gran cantidad de información muy importante, pero no suficiente, para el conocimiento de los procesos biológicos. El desarrollo de la proteómica ha experimentado un enorme avance en los últimos años, gracias fundamentalmente a la secuenciación completa de un cada día mayor número de genomas (entre ellos el humano), al desarrollo tecnológico (especialmente en espectrometría de masas) y al diseño de herramientas bioinformáticas que permiten analizar una gran cantidad de información compleja en poco tiempo.

La secuenciación completa del genoma humano posibilitó conocer el número de genes que poseemos, y ha permitido observar que dicho número es inferior a lo que se pensaba (aproximadamente 25.000, frente a los 100.000 esperados), y también que su secuencia guarda alta homología con la de otros organismos. Por ello, la complejidad de los organismos (y especialmente del hombre) parece actualmente radicar con mucho mayor peso en las proteínas, ya que son éstas moléculas las responsables de llevar a cabo las funciones en la célula, tejido o fluido en que se encuentran, y también porque están sujetas a finos mecanismos de modulación que engloban:

  1. Procesos de transcripción y traducción alternativa (un gen puede dar lugar a diferentes formas proteicas).
  2. Modificaciones post-traduccionales esenciales para la función proteica.
  3. Interacciones con otras proteínas o ácidos nucleicos para formar complejos funcionalmente activos.
  4. Variaciones en la localización de estas proteínas dentro de la célula.

Todas estas áreas son objeto de estudio en proteómica, que proporciona un conjunto de herramientas muy poderosas para el estudio a gran escala de la función de los genes a nivel de proteína. La aplicación de la proteómica tiene un enorme potencial en el área de la biomedicina para el desarrollo de métodos de diagnóstico precoz, diseño de terapias alternativas, identificación de proteínas diana, desarrollo de fármacos, estudios de mecanismos de patogénesis, etc.

Objetivos

La Plataforma de Proteómica del INIBIC tiene dos objetivos fundamentales:

  1. Proporcionar recursos técnicos como servicio de apoyo a la investigación.
    • Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas.
    • Separación y análisis de proteomas mediante electroforesis bidimensional o cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas.
    • Implementación, desarrollo y estandarización de nuevas técnicas proteómicas.
  2. Llevar a cabo tareas de formación.
    • Docencia de la asignatura “Proteómica” en estudios de posgrado de la Universidade da Coruña
      • Máster en Biología Molecular, Celular y Genética.
      • Máster en Asistencia e Investigación Sanitaria (especialidad en Fundamentos de Investigación Biomédica).
    • Asesoramiento para el diseño experimental de análisis proteómicos.
    • Supervisión y asesoramiento a usuarios que empleen técnicas proteómicas en el INIBIC/UdC.

Personal

Dra. Cristina Ruiz Romero
Dra. Cristina Ruiz RomeroAsesora Científica

Equipamiento

En la actualidad, la Plataforma de Proteómica del INIBIC posee la siguiente infraestructura para análisis de proteínas a gran escala:

Equipos para separación y análisis de proteínas mediante electroforesis bidimensional

Procesador de tejidos STP 120

Sistemas de isoelectroenfoque Ettan™ IPGphor™ e IPGphor™ 3 (Ge Healthcare) con bandeja de rehidratación y soporte IPGphor Manifold para correr simultáneamente 12 tiras de gradiente de pH inmovilizado de 7 a 24 cm.

Procesador de tejidos STP 120
Procesador de tejidos STP 120

Sistemas de separación de proteínas en 2ª dimensión: unidades de electroforesis MiniProtean (Bio-Rad), SE600 Ruby (GE Healthcare) y Ettan™ DALTsix (GE Healthcare), para tamaños de geles de hasta 24×26 cm.

Procesador de tejidos STP 120

Escáner de alta resolución ImageScanner (GE Healthcare), para digitalización de geles teñidos con Coomassie o nitrato de plata.

Procesador de tejidos STP 120

Cámara CCD equipada con fuentes de excitación de 460 y 520 nm (Fujifilm), para digitalización de geles teñidos con compuestos fluorescentes (SYPRO, etc).

Procesador de tejidos STP 120

DIGE Imager (GE Healthcare), para digitalización de geles DIGE o teñidos con fluorescentes (SYPRO, etc).

Procesador de tejidos STP 120

Cámara CCD Amersham Imager 600 (GE Healthcare), para la detección y digitalización de fluorescencia o quimioluminiscencia en geles y membranas (Western blot)

Procesador de tejidos STP 120

Software de análisis de geles bidimensionales PDQuest™ 7.3.1 (Bio-Rad). Este programa permite la identificación, cuantificación y análisis de las manchas proteicas presentes en los geles 2-DE.

Procesador de tejidos STP 120

Software de análisis de geles bidimensionales Progenesis SameSpots 4.0 (Nonlinear Dynamics)

Equipos para separación de proteínas mediante cromatografía líquida

Procesador de tejidos STP 120

1200 Series LC (Agilent Technologies), HPLC para cromatografía líquida de alta resolución. Con sistema de inyección automática, bomba cuaternaria, detector UV y colector de fracciones (Gilson). Columnas disponibles:

  • Zorbax C18 (fase reversa)
  • PolyLC (SCX)
  • ProteoPrep 20 (inmunoafinidad, para depleción de las 20 proteínas mayoritarias presentes en suero)
  • MARS Hu-14 (inmunoafinidad, para depleción de las 14 proteínas mayoritarias presentes en suero)
Procesador de tejidos STP 120

Sistema Tempo™ nanoLC (Applied Biosystems), para cromatografía líquida de alta resolución y nanocaudal (nL/min). Acoplado a colector de microfracciones.

Procesador de tejidos STP 120

Colector y dispensador de microfracciones SunCollect (SunChrom), para depositar las fracciones del nLC sobre una placa para MALDI.

Identificación de proteínas

Procesador de tejidos STP 120

Espectrómetro de masas 4800 MALDI-TOF/TOF™ Proteomics Analyzer (Applied Biosystems). Posee fuente de ionización tipo MALDI y dos analizadores de masas tipo tiempo de vuelo en tándem con cámara de colisión (CID) para fragmentación de iones.

Procesador de tejidos STP 120

Software Protein Pilot 3.0 (Applied Biosystems), para la identificación de proteínas a partir de geles bidimensionales o ensayos de nLC-MALDI-TOF/TOF, así como para la cuantificación de proteínas tras marcaje in vitro (ICAT, iTRAQ) o in vivo (SILAC).

Procesador de tejidos STP 120

Sistema de cromatografía líquida Tempo™ nanoLC-2D acoplado a espectrómetro de masas QTRAP5500. El sistema AB SCIEX QTRAP® 5500 LC-MS/MS es un triple cuadrupolo combinado con una aceleradorTM tipo trampa. Tiene dos fuentes de ionización por electrospray (fuente nano y fuente turbo).

Procesador de tejidos STP 120

MultiQuantTM Software Version 2.1 (Applied Biosystems), para el análisis de datos generados por los sistemas LC-MS/MS (QTRAP5500 y API 3200) mediante la técnica multiple reaction monitoring (MRM) de diferentes analitos.

Servicios ofertados

Determinación de masas moleculares

  1. Determinación de masas moleculares de proteínas y péptidos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF.

Identificación de proteínas

  1. Identificación de proteínas mediante huella peptídica (MALDI-TOF).
    • Digestión enzimática con tripsina de las manchas proteicas a partir de geles de 2-DE, geles SDS-PAGE (1-D), o proteínas en solución.
    • Análisis de los péptidos mediante espectrometría de masas tipo MALDI-TOF. Obtención del mapa o huella peptídica.
    • Búsqueda en bases de datos e identificación de la proteína.
  2. Identificación de proteínas por fragmentación de péptidos mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF/TOF).
    • Digestión enzimática con tripsina de las manchas proteicas a partir de geles de 2-DE o SDS-PAGE (1-D) o proteínas en solución.
    • Selección de precursor y secuenciación de novo (MS/MS).
    • Búsqueda e identificación de la proteína mediante, mediante la(s) secuencia(s) de péptidos (datos MS/MS).
  3. Secuenciación de péptidos mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF/TOF).
  4. Identificación de mezclas de proteínas mediante nLC-MALDI-TOF/TOF.
    • Separación de mezclas de péptidos de diferente complejidad mediante nanocromatografía líquida capilar acoplada a un microcolector de fracciones para su posterior análisis mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF.

Cromatografía

  1. Separación de proteínas mediante cromatografía líquida.
    • Fase reversa (Zorbax)
    • Intercambio catiónico (SCX, PolyLC)
  2. Depleción de proteínas mayoritarias de suero por inmunoafinidad.
    • 20 mayoritarias (ProteoPrep 20, Sigma)
    • 14 mayoritarias (MARS Hu-14, Agilent)

Electroforesis

  1. Separación de proteínas mediante electroforesis monodimensional (SDS-PAGE).
  2. Separación de proteínas mediante Electroforesis Bidimensional (2-DE).
    • Esta técnica se basa en la separación de las proteínas en función a dos características: su punto isoeléctrico, pI (Isoelectroenfoque, IEF) y su peso molecular (Electroforesis en condiciones desnaturalizantes, SDS-PAGE).
    • Puede llevarse a cabo en geles de 7, 13, 18 y 24 cm, según la resolución requerida.
  3. Tinción de geles mono- y bidimensionales
    • Azul de Coomassie (clásica y coloidal)
    • Nitrato de Plata
    • Tinción fluorescente (SyproRuby)
  4. Análisis de imagen de geles bidimensionales (PDQuest o SameSpots)

Proteómica diferencial

  1. Estudios de electroforesis diferencial en gel (2D-DIGE)
    • Marcaje de las muestras proteicas de las condiciones a comparar con Cy2, Cy3 o Cy5.
    • Separación de las mezclas de muestras marcadas mediante 2-DE.
    • Digitalización de las imágenes en escáner DIGE Imager.
    • Análisis de imagen (SameSpots).
  2. Marcaje metabólico de proteínas (SILAC) para análisis por LC-MS/MS
  3. Marcaje isobárico de péptidos (iTRAQ) para análisis por LC-MS/MS
  4. Análisis informático para la identificación y cuantificación de proteínas por LC-MS/MS (ProteinPilot)

Otros

  1. Transferencia de geles a membrana
  2. Escaneado de geles
    • Visible (Coomassie, plata…)
    • Fluorescencia (Sypro, DeepPurple, Cys…)
  3. Preparación de muestras
    • Precipitación de proteínas.
    • Desalado (ZipTip o equivalente).

Tarifas

Módulo Técnica Unidad A B C
Preparación de muestras
001 Extracción de proteínas Muestra 10€ 15€ 20€
002 Precipitación muestra Muestra 25€ 35€ 48€
003 Depleción química Muestra 25€ 35€ 48€
004 Desalado y concentración por fase reversa Muestra 15€ 20€ 25€
005 Desalado y concentración por ultrafiltración Muestra 17€ 25€ 30€
006 Cuantificación de proteínas (Bradford, BCA, etc) Muestra 15€ 20€ 25€
007 Digestión (estándar) Muestra 15€ 20€ 25€
Marcaje para proteómica cuantitativa
101 Marcaje isobárico (TMT, iTRAQ) 4-plex 290€ 350€ 500€
8-plex 525€ 630€ 900€
103 Marcaje DIGE (por gel) 3-plex 280€ 360€ 600€
Separación de péptidos y proteínas
Electroforesis (IEF o SDS-PAGE)
201 Isoelectroenfoque, tira corta Muestra 25€ 35€ 50€
203 Isoelectroenfoque, tira larga Muestra 35€ 45€ 60€
208 SDS-PAGE (minigel) Gel 25€ 35€ 50€
210 SDS-PAGE (gel grande) Gel 50€ 70€ 90€
Tinción de proteínas en geles de poliacrilamida
211 Tinción con nitrato de plata (minigel) Gel 40€ 60€ 80€
212 Tinción con nitrato de plata Gel 50€ 75€ 100€
213 Tinción con azul de coomassie (minigel) Gel 20€ 30€ 45€
214 Tinción con azul de coomassie Gel 35€ 50€ 75€
215 Tinción fluorescente (minigel) Gel 40€ 60€ 80€
216 Tinción fluorescente Gel 60€ 80€ 110€
217 Picado de spots a partir de gel Hora 10€ 15€ 20€
Escaneado de geles
218 Escaneado no fluorescente Gel 8€ 12€ 17€
219 Fluorescencia (Typhoon o similar) Gel 15€ 20€ 30€
Cromatografía líquida
220 Separación por HPLC (fase reversa o intercambio iónico) Muestra 220€ 270€ 350€
222 Inmunodepleción de suero Muestra 300€ 400€ 500€
Análisis por espectrometría de masas
301 Análisis por MS-MALDI TOF (huella peptídica) Muestra 34€ 49€ 64€
302 Análisis por MS-MALDI TOF/TOF Muestra 69€ 79€ 94€
312 LC-MS/MS (triple cuadrupolo, MRM) Run Consultar
314 LC-MALDI (gradiente corto) Run 150€ 200€ 300€
315 LC-MALDI (gradiente medio) Run 200€ 300€ 400€
316 LC-MALDI (gradiente largo) Run 300€ 400€ 500€
Análisis de datos
401 Análisis de datos de espectrometría de masas Hora 50€ 70€ 90€
402 Análisis de datos de espectrometría de masas (autoservicio) Hora 15€ 25€ 40€
403 Análisis de imagen Hora 60€ 80€ 100€
404 Análisis de imagen (autoservicio) Hora 15€ 25€ 40€
Otros análisis
506 Transferencia de proteínas a membrana Gel 35€ 45€ 60€
517 Diseño experimental Hora 10€ 20€ 30€
518 Realización de informes Hora 15€ 25€ 40€
519 Trabajo de técnico Hora 15€ 25€ 40€

Tarifa A INIBIC y grupos asociados.
Tarifa B Resto de centros y organismos de investigación públicos.
Tarifa C Empresas y entidades privadas.

Consultar disponibilidad y precio para servicios no incluidos en este listado.
Consultar requisitos en la preparación y envío de muestras para su análisis.

Solicitudes

La Plataforma de Proteómica del INIBIC ofrece un servicio de apoyo a la investigación a los laboratorios miembros del Instituto, así como a la Universidade da Coruña, a la plataforma del CIBER-BBN y a otras instituciones públicas o privadas. La lista de tipos de análisis que se ofertan puede consutarla en la sección Servicios ofertados.

Procedimientos para la solicitud de los servicios

La solicitud de un servicio puede realizarse de dos formas alternativas:

  1. Rellenar el/los Formulario/s de Solicitud correspondientes, disponibles en esta misma página. Una vez cumplimentados se enviarán por fax o correo electrónico, junto con las muestras a analizar.
    Es necesario rellenar el formulario de Solicitud de Servicio de la Plataforma de Proteómica, y uno de los formularios específicos de cada tipo de análisis.

Solicitud de Servicio de la Plataforma de Proteómica

Electroforesis

Cromatografía

Espectrometría de masas

En el caso de solicitar únicamente presupuesto para un análisis en concreto, puede cumplimentarse el formulario de Solicitud de Presupuesto de la Plataforma de Proteómica.

Formulario de solicitud de presupuesto

A través de la página web del Instituto Nacional de Proteómica (ProteoRed), en la dirección www.proteored.org, mediante las instrucciones que se le facilitan a continuación.

Instrucciones Proteored

Envío de muestras

Una vez cumplimentada la solicitud, las muestras a analizar se podrán entregar de cualquiera de las siguientes formas:

  1. Mediante servicio de mensajería con portes pagados o correos a la dirección indicada en la sección de contacto
  2. Entrega directa en el laboratorio: Edificio anexo al Hospital Materno Infantil Teresa Herrera, 2ª planta.

Antes de su envío, es indispensable seguir las Instrucciones para el envío de muestras que se encuentran en esta página web.

Entrega de resultados

Los resultados de los análisis solicitados se enviarán por correo electrónico, o se recogerán en la Plataforma de Proteómica. El plazo de entrega de los resultados dependerá de la saturación del Servicio en cada momento, así como de las características del análisis solicitado.

Instrucciones para el envío de muestras

Las siguientes instrucciones son orientativas para los usuarios, y su objetivo es que las muestras puedan ser analizadas en las mejores condiciones posibles, prevenir degradaciones y/o contaminaciones.
Las muestras deben manipularse con extremo cuidado para evitar contaminación con queratinas, que suelen proceder de manos, pelo y ropa de tejido animal, o con otros contaminantes que posteriormente puedan interferir en el análisis mediante espectrometría de masas.
Las muestras deben ir perfectamente identificadas, a ser posible con una simple numeración. Independientemente del tipo de muestra, es necesario indicar el organismo de procedencia de la misma.
Es importante que el usuario advierta de los posibles riesgos que pueda conllevar la manipulación del material enviado, ya sean tóxicos o biológicos, así como de las medidas de seguridad necesarias. Si el material tuviera potencial infeccioso deberá manifestarse, explicando las condiciones en que debe ser manipulado.

Muestras en solución

Las muestras se enviarán preferentemente liofilizadas, junto con la descripción de las mismas requerida en el Formulario de Solicitud de Servicio. Dicha descripción debe incluir su procedencia, cantidad aproximada y la composición de la solución en la que se encontraban previamente (tampones, sales, etc.).
En caso de no enviarse liofilizadas deberán enviarse en frío (preferentemente, congeladas), y se incluirá el tipo de tampón en el que se encuentran, el volumen y la concentración de proteína.

Muestras en gel de poliacrilamida

Los geles se deben preparar con reactivos de grado analítico y agua ultrapura. Es preferible que su grosor no sobrepase 1 mm, y que el porcentaje de acrilamida no exceda el 12%. Siempre deben incluirse en el gel marcadores de peso molecular.
La tinción del gel puede llevarse a cabo con Coomassie (normal o coloidal), compuestos fluorescentes (SyproRuby, Flamingo o similares) o nitrato de plata. En este último caso, es importante que el protocolo de tinción sea compatible con espectrometría de masas.
Las muestras se enviarán en agua ultrapura, preferiblemente en frío. Pueden enviarse:

  • Los geles completos, con una imagen de las bandas o manchas que se quieren analizar
  • Las bandas o manchas de proteínas que se quieren analizar ya recortadas, en tubos eppendorf. Para recortarlas, es importante emplear material completamente limpio (bisturí, puntas desechables) y ceñirse al contorno de la tinción para evitar aumentar la proporción de acrilamida en la muestra. Asimismo, debe recortarse un trozo pequeño del gel que servirá como blanco para el análisis. Las muestras deberán ir acompañadas de una imagen del gel de procedencia y su localización en el mismo.

En cualquier caso, todo usuario que desee consultar condiciones específicas de sus muestras, o del tipo de análisis requerido, puede ponerse en contacto en cualquier momento con el personal técnico de la Plataforma de Proteómica.

Contacto

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Plataforma de Proteómica INIBIC-CHUAC
Hospital Teresa Herrera (Edificio anexo – 2º piso)
Xubias de Arriba, 84
15006 A Coruña
Teléfono: 981 17 82 72
Fax: 981 17 82 73
Coordenadas: 43º20’39”N 8º23’20”W
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